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介绍： 聚山梨酯（PS）是一类两亲性，非离子表面活性剂家族，其来自被脂肪酸酯化的乙氧基化脱水山梨糖醇或异山梨醇（山梨糖醇的衍生物）。聚山梨酸酯，特别是聚山梨酸酯20（PS20）和聚山梨酸酯80（PS80），是生物药物制剂中使用最广泛的表面活性剂，可防止蛋白质在融化过程中变性、聚集、表面吸附和絮凝剂制剂。
作为蛋白质稳定剂的聚山梨酸酯是化学上多样化的混合物，并且可以通过氧化和水解途径降解，其中水解途径是化学诱导的或酶催化的。由于聚山梨酯降解可能会无意中影响蛋白质制剂的质量、功效、安全性和稳定性，因此，药品监管部门对聚山梨酯控制策略的审查日益严格，以确保在药物产品的保质期内聚山梨酯含量保持恒定。
正如一些文献所总结的那样，在改善我们对聚山梨酯降解途径和根本原因的当前理解方面取得小丸工具箱2014了重大进展，从而能够实施适当的聚山梨酯控制策略。然而，聚山梨酯降解已经成为我们行业中治疗性蛋白质产品的开发和商业化的主要挑战之一。下面我们在提供有关聚山梨酯不同方面的详尽概述，但将重点介绍我们行业当前面临的挑战。
吐温的优点：
PS20和PS80在大多数商业治疗性蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂。这是由于以下因素的组合：
1）生物相容性；
2）低毒；
3）有效的蛋白质稳定作用。即使在低浓度下，由于PS20和PS80的亲水亲脂平衡（HLB）值高和临界胶束浓度（CMC）低，它们也提供了足够的蛋白质稳定性。
尽管尚不清楚聚山梨酯如何稳定蛋白质，但已提出界面竞争和表面活性剂-蛋白质复合为两个主要机理。
通常认为PS20和PS80主要通过界面竞争来稳定蛋白质。PS20和PS80的表面活性比典型的治疗性蛋白质（例如单克隆抗体（mAbs））高得多，因此，它们可以竞争性地阻断界面并抑制蛋白质吸附到气液界面。该特性可有效防止蛋白质在制造过程、样品处理和存储（包括混合、过滤、泵送、摇动、搅动和冻融）中在界面处展开。同样，它也可以防止蛋白质吸附以及随后在产品接触表面（例如过滤器、主要容器/密闭容器和静脉注射管）上的损失，在确保向患者准确递送剂量方面起着至关重要的作用。
PS20和PS80还可以通过直接相互作用来稳定蛋白质，从而增加蛋白质的胶体稳定性。治疗性蛋白质可能会通过其疏水斑块合并形成聚集体。聚山梨酸酯可通过疏水相互作用与蛋白质表面上的疏水补丁相互作用，从而防止蛋白质聚集和进一步的聚集展开。但是，表面活性剂与蛋白质的直接相互作用以及随后蛋白质胶体稳定性的改善可能是蛋白质特异性的，不能广泛应用。例如，一项热力学研究表明，聚山梨酯与人血清白蛋白结合，但是，发现表面活性剂与三种被研究的免疫球蛋白的结合非常低，可以忽略不计。
吐温的缺点：
市售的PS20和PS80是化学上多种多样的混合物，PS20（聚氧乙烯（20）脱水山梨糖醇单月桂酸酯）和PS80（聚氧乙烯（80）脱水山梨糖醇单油酸酯）的预期结构仅占聚山梨酸酯总量的20％。如下 图1所示，异质性不仅来自亲水性头基和脂肪酸尾部，还来自与工艺相关的杂质，副产物的含量等，如 图1所示。不同的合成路线和所用原料可能会导致批次差异。PS80的市售价格为多药典（MC）级和中国药典（ChP）级，所需的最低油酸含量分别为58％和98％。
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此外，聚山梨酯结构缺乏强发色团，无法检测到容易获得的紫外可见光和荧光。结果，已经开发了多种方法来监测聚山梨酯的不同性质，如下 表1所示。 表1总结了每种PS含量方法的基础不同，但总的来说是准确而可比的PS含量可以通过不同方法获得无应力样品。然而，由于降解后每种亚种（单酯或聚酯）对总PS含量结果的贡献存在显着差异，因此用不同方法测量的应力样品中的PS含量显示出明显的差异。
表1：正在开发检测聚山梨酯含量的分析方法清单
除PS含量法外，还经常采用基于反相液相色谱并与通用检测器（例如CAD，ELSD或质谱法）串联的PS纯度法来分析主要PS亚种的组成。还开发了多种基于LC、气相色谱（GC）、核磁共振（NMR）或比色法的方法，并将其用于检测聚山梨酯降解物，例如小的有机分子，游离脂肪酸，H2O2，以了解聚山梨酯降解途径。如综述文章所述，构建分析工具箱以表征聚山梨酯已取得了重大进展。然而，全面表征PS20和PS80及其降解物仍然是一项分析挑战。随着分析技术的发展，分析工具可能会继续发展。
上述独特的物理化学性质不仅在从原材料控制和分析策略的角度制定适当的聚山梨酯控制策略方面，而且在阐明如下面所述的聚山梨酯的结构与功能关系方面都提出了独特的挑战。
尚需阐明每种类型的PS亚种和副产物在商业PS中作为蛋白质稳定剂所起的作用，但是最近已经取得了一些进展。富集ChP级的PS20（全月桂酸酯）和PS80（全油酸酯）的单酯和二酯级分，并通过小角中子散射检查其在溶液中的胶束形态。胶束的大小和聚集数随温度的升高而增加；然而，单酯部分显示出与二酯部分不同的温度依赖性。PS20和PS80二酯级分显示出比单酯级分更高的胶束聚集数。在另一项相关研究中，测量了PS20和PS80的单酯部分和二酯部分的CMC。有趣的是，在搅拌研究中，PS20馏分显示出非常不同的CMC值，并且对mAb的聚集和颗粒形成的稳定作用差异很大。相反，所有PS80馏分的CMC值彼此相似且在约3倍范围内。
ChP级的PS20和PS80通过消除脂肪酸引入的异质性，其分子异质性比MC级的分子异质性小得多。尚待观察的是，MC级的聚山梨酸酯的酯级分是否具有与ChP级的相似的理化性质（胶束形态，CMC，表面张力）。ChP级和MC级PS80均表现出在机械应力下可比的mAb稳定作用。然而，发现ChP级的PS20和PS80表现出更高的氧化降解倾向，但对敏感性和酶水解的敏感性与MC级相似。是否暗示MC级PS20和PS80中存在的异质性提高了其抗氧化的稳定性小丸工具箱2014？
吐温的降解：
聚山梨醇酯是通过氧化和水解，易发生降解如下 图2所示，与任一被诱导的化学或酶促水解。聚山梨酯的降解，根本原因和影响将在下面更详细地讨论。
聚山梨酯的水解涉及脂肪酸酯键的裂解，所得释放的游离脂肪酸可形成不可见或可见的颗粒。有人提出，酶诱导的聚山梨酸酯水解是影响产品质量的可见和亚可见颗粒形成的主要原因，在典型的蛋白质制剂pH下，聚山梨酸酯水解受到限制。据报道，在蛋白质配方中诱导多山梨酸酯水解的24种残留宿主细胞蛋白包括几组溶酶体磷脂酶A2异构体X1（LPLA2）、25种确定的磷脂酶B-like-2（PLBL2）、26种肝羧酸酯酶。共纯化的脂肪酶是催化脂肪或脂质水解的酯酶的一个亚类，往往具有与目标蛋白质相似的理化性质，因此很难去除。已尝试从中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中剔除脂蛋白脂肪酶（LPL），使LPL表达降低95％以上，但只能将聚山梨酸酯降解降低41-57％，提示其他脂酶可能是不起作用的。来自不同物种的一系列羧酸酯水解酶用于诱导PS20和PS80水解。发现降解模式不仅取决于水解酶，而且取决于PS亚种的类型，例如酯的顺序，亲水性头基的身份和脂肪酸链长。没有PS亚种完全可以抵抗酶水解。最近，排除了推定的磷脂酶B 2（PLBL2）作为通过基因敲除和免疫耗竭PLBL2诱导蛋白质制剂中PS水解的根本原因。有争议的报道结果可能是由于促进聚山梨酯水解的脂肪酶远低于检测极限，因此难以追踪，监测或关联导致PS水解的脂肪酶。
聚山梨酯也可能被温度，光或过渡痕量金属自动氧化，生成的过氧化物可能引起蛋白质氧化，而生成的酸可能导致溶液pH降低。聚山梨酯的氧化主要发生在聚氧乙烯（POE或PEO）链上，这会导致POE酯和其他降解物，例如短链烷烃，酮，醛和酸等。聚山梨酯的氧化也可能在脂肪酸部分上发生“不饱和脂肪酸” ，其中不饱和脂肪酸例如油酸酯和亚油酸酯部分被优先攻击。两个部分上的氧化被视为由引发，繁殖和终止组成的自由基链过程。有趣的是，最近有报道称，氧化的PS80在保持其CMC特性的同时，其表面活性有所提高，并且对mAb的聚集具有保护作用。相反，通过水解降解的PS80导致表面吸附较慢。水解过程中释放的游离脂肪酸也会形成不溶性颗粒，对蛋白质质量和稳定性产生负面影响。
组氨酸，一种常用的蛋白质制剂缓冲剂，可能对PS降解产生混杂的影响。据报道，L-组氨酸对PS20的稳定性具有双重作用。在2,2'-偶氮双（2-ami基丙烷）盐酸盐（AAPH）胁迫研究中，L-组氨酸可作为活性氧的清除剂，以保护PS20，而在40°C的溶液中加速存储期间，它可促进PS20氧化。在另一项研究中，在组氨酸安慰剂缓冲液中观察到PS氧化，然而，发现在组氨酸缓冲液中的痕量金属污染物是根本原因，因为在其他条件相同的条件下添加EDTA可以抑制PS氧化。还报道了组氨酸氯化物缓冲液可促进组氨酸咪唑催化的安慰剂中的聚山梨酯水解。然而，在存在治疗性蛋白质的情况下，组氨酸催化的聚山梨酯水解作用降至最低。
吐温作为辅料有没有可以替代的新品种？
泊洛沙姆188（P188）是另一种在蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂的赋形剂，尽管不如PS20和PS80广泛。吸附动力学测量表明，P188通过与溶液中的蛋白质相互作用来抑制固体界面上的蛋白质吸附，而PS20和PS80通过竞争性结合并阻止蛋白质进入界面来稳定界面上的蛋白质。P188可能主要通过氧化途径在溶液中降解，形成氧化的PEO和小的聚环氧丙烷（PPO）物质。发现组氨酸和P188在组氨酸缓冲液中在药学上相关的条件下均被氧化，由于组氨酸和P188降解物之间的反应而检测到新物种。
在过去的几年中，还尝试了其他一些新型的赋形剂作为PS的替代品，试图避开由残留脂肪酶引起的聚山梨酯水解问题。已发现Brij-5843和FM10006是有前途的PS替代品，可能具有抗脂肪酶水解的能力。但是，在将这些新型赋形剂中的任何一种引入治疗性蛋白质制剂中并送给患者之前，需要做大量工作。
结论
PS20和PS80，作为有效的蛋白质稳定剂，是被批准用于肠胃外给药的蛋白质制剂中广泛使用的赋形剂。但是，市售的PS20和PS80是化学上不同的混合物，并且聚山梨酯的结构缺乏强生色团。这些独特的物理化学性质的组合在开发聚山梨酯控制策略和阐明聚山梨酯的结构-功能关系方面提出了挑战。
PS20和PS80也可能通过氧化和水解途径降解，并对产品质量和稳定性产生负面影响。在过去的几年中，由于残留脂肪酶催化的聚山梨酯水解，可见/亚可见脂肪酸颗粒形成的报告越来越多。当可能发挥作用的残留脂肪酶的丰度非常低（例如ppb水平）时，要积极地检测和鉴定脂肪酶并将其与高蛋白浓度的聚山梨酸酯水解相关联，将带来巨大挑战。为了克服与检测/鉴定/去除导致PS水解的低丰度脂肪酶相关的挑战，已经研究了对脂肪酶水解具有抗性的新型赋形剂作为潜在的PS替代品。
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