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摘要
这些年来小丸工具箱报毒，在研的用于治疗癌症的基因疗法方案产生小丸工具箱报毒了指数式的增长。这应归功于我们对于造成癌症发病和持续的分子机理认识的不断增加以及基因转运载体的发展。在这篇综述中，我们将关注于慢病毒载体（LVs）在癌症免疫基因疗法中的应用，由于其很多诱人的特性这些高效的基因运输载体被推到了前沿。LVs被成功应用于产生以有效的树突状细胞为基础抗肿瘤疫苗以及将降肿瘤特异性的受体运输到T细胞。此外，与癌细胞调整有关的LVs也在研究中。我们会说明这种“真正的”癌症基因疗法的多种策略，其中有包括自杀基因的传输、促凋亡和抗凋亡分子的调节、优化化疗和放疗的策略、影响肿瘤细胞血管生成和免疫原性分子的表达。这些会基于我们现有的肿瘤免疫知识来进行讨论。最后我们会讨论一些重要的问题和此领域前进的未来方向。
1、一般介绍
尽管慢病毒载体（LVs）是基因疗法中相对比较新的成员，它们已经被证明在包括癌症基因疗法的多种不同的应用中非常有效。在很多方面LVs与γ-反转录病毒载体（γ-RV）具有可比性。它们都能稳定的将其荷载整合进靶细胞的基因组，这样就能达到感兴趣基因的持续表达。此外LVs有三个显著的特性使其相较于γ-反转录病毒载体（γ-RV）更适用于基因疗法。首先，LVs可以容纳高达10kb大小的基因。其次，LVs在宿主基因组中选择较为“安全”的整合位点。第三点，LVs可以转导分裂细胞和非分裂细胞。关于癌症免疫疗法，已经利用LVs转导了包括树突状细胞和T细胞在内的多种免疫细胞，因此开启了免疫治疗策略的一个新时代。此外，还证明了LVs是转导肿瘤细胞的优秀载体。本文中我们会概述LV发展和肿瘤免疫学的基础知识，因为这些是这篇文章剩余部分中讨论的以LV为基础的免疫基因疗法策略的基础。我们会特别的关注在研的“真正的”以LV为基础的癌症基因疗法策略，在可能时将其能力和我们关于肿瘤免疫学知识联系起来。
2、慢病毒载体发展中的基础知识
2.1 慢病毒载体的发展
人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1），逆转录病毒科中的一员，是被研究最彻底的慢病毒。因此，源自这个病原体的LVs是最多的也就不足为奇了，尽管也有来源于诸如马传染性贫血病毒、猴和猫免疫缺陷病毒的非HIV慢病毒LVs。慢病毒有着与γ-反转录病毒载体（γ-RV）相同的特性。两者都是有包膜的RNA病毒，含有gag, pol和env基因，分别编码病毒结构蛋白、病毒多聚酶以及包膜糖蛋白。诸如HIV-1的慢病毒还含有6个额外的病毒蛋白。调节性蛋白tat和rev以及附属性蛋白vif, vpr, nef和vpu。
这些年来，为了提升自身的安全性和有效性，用于制造LVs的载体系统经历了显著的改进。在我们讨论这些之前，一件重要的事就是要说明LVs通过将一个传输载体、包装载体以及一个包膜蛋白编码载体瞬时转染人胚胎肾293T细胞制得。这其中，传输载体提供了病毒RNA，其中包含两个长末端重复序列（LTR），一个Rev反应元件（RRE），一个包装信号（Ψ）以及一个表达盒。如前所述，HIV-1包含两个调节性基因tat和rev。为了避免具有复制能力的LVs的形成（RCL），这些基因会由包装载体通过反式构建到第二代LVs中，而在第三代LVs中，通过在传输载体引入一个巨细胞病毒（CMV）启动子/LTR杂交体来排除对tat的需求。另一个安全措施是开发自我灭活的LVs（SIN）。这些载体中3’端的部分LTR被删除，这样取消了LTR的启动子活性从而降低了RCL和插入突变的风险。为了增强安全性可以进一步向LVs中加入多聚腺苷酸化增强子、隔离子、没有增强子能力的内部启动子或是可调节性转基因表达。关于载体性能，单独引入中心聚嘌呤区（cPPT）或将其和中心终止序列和用来加强对几种细胞类型的转到，因为这种cPPT提升前病毒DNA向核内的运输。
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尽管前面提到了第二代和第三代LVs这样的术语，需要澄清的是LV是以包装系统为基础分代的。第一代包装系统提供的是辅助基因、调节基因、gag和pol基因。为了把产生RCL的风险降到最低，在第二代包装构建中将附属基因移除。在第三代中，不再需要tat基因，因为在载体转录本的上游使用了组成型启动子。此外，还用单独的质粒编码了gag/pol基因和rev基因。通过开发整合酶缺陷性的LVs（IDLVs）进一步提升了安全性。尽管与γ-反转录病毒载体（γ-RV）相比遗传毒性较低，它们的确是整合在宿主基因组中。通过使用整合酶突变的包装构建制造LVs时可以避免整合。使用IDLVs进行转导导致游离环状载体生成。尽管这些会受到分裂细胞的稀释而产生丢失，已知这些载体在静息期细胞中还是稳定的。
LVs生产中的关键在于编码薄膜糖蛋白的构建。通常都是带有一个异源糖蛋白的假型LVs以绕开野生型HIV糖蛋白有限的宿主范围。尽管有多种病毒的糖蛋白被应用，最常用的还是水泡性口炎病毒（VSV-G）的包膜糖蛋白，因为它可以感染的靶细胞范围很广并且赋予载体了稳定性。为了进一步提升LVs的安全性情况，正在多种策略的开发以便特异性的将LVs导向靶细胞，不仅仅是通过转导而且还有靶向转录。稍后将在癌症基因疗法中对这些进行讨论。
2.2 慢病毒载体与其他载体系统的比较
尽管对其他基因运输系统的说明超出了本综述的范围，我们还是倾向于指出院子其他病毒的重组病毒载体，其中有腺病毒（AVs）、腺相关病毒（AAVs）以及单纯疱疹病毒（HSVs）。在表1中给出了这些系统的主要特性与LVs的对比。
LVs的一种特性，就是其激活免疫反应的能力值得一说。免疫系统，特别是抗原递呈细胞都具备病原体识别受体（PRRs），使其能感受到病毒感染。之后，免疫系统被激活到某种程度。尽管转基因特异性的免疫有利于诱导针对癌症的免疫反应，当需要转基因长期表达时不期望它们出现。有报告说LV运载的转基因的稳定表达受到白介素-6（IL-6）和I型干扰素诱导快速而短暂的抑制。这种细胞因子分泌情况可能是由于LVs通过包括toll样受体在内的多种PRR诱导和激活髓系以及浆细胞样DC造成的。
表1：病毒载体系统
载体
基因组
插入（kb）
进入
定位
时长
免疫反应
RV
ssRNA
7
融合
整合
长期
中等
LV
ssRNA
10
融合
整合
长期
中等
AV
dsDNA
36
受体
游离
短期
强烈
AAV
ssDNA
4
受体
整合
长期
可忽略
HSV
dsDNA
30
融合
游离
短期
强烈
关于平常用于将遗传物质导入细胞的5种系统的基因组类型、插入基因容量、进入模式、病毒基因组定位（转基因）和转基因表达的时长以及与伴随着病毒载体的免疫反应的概述。值得注意的是，从其初始开发开始每种系统都受到了不断修饰，例如使其中外源性基因容量不断增大，特别是对于AV而言具有巨大的克隆容量。某些系统，诸如RVs、LVs和AAVs便于转基因的长期表达。AVs也表现出转基因表达时长增加，特别是使用CMV修饰病毒表达盒的启动子。重要的是，针对每种系统的宿主免疫反应是迥然不同的，针对AAVs的免疫反应时可以忽略的、而针对RVs和LVs的免疫反应为中等强度、而针对AVs和HSVs的免疫反应很强烈。载体基因组的免疫反应及其整合入宿主基因组的能力决定了转基因表达的持续时间。
总体而言，LVs可以携带较大的插入基因并将其高效的导入分裂细胞和静息期细胞并在之后进行高水平和长期的基因表达。这其中只有很小的毒性或没有毒性，同时只在体内引起短暂的免疫反应。在很多方面，诸如转导和翻译是可以被调节的，理论上这些载体适用于进行癌症基因疗法。
3. 肿瘤免疫学的基础知识
3.1 炎症：肿瘤的一个标志
已经对肿瘤发展和进展的分子机理进行了广泛研究。以从这些研究获得的知识为基础，其中要说明的一些是和炎症有关联的。尽管在一个世纪以前Rudolf Virchow就做出了假设，只是在最近癌症由炎症开始这一概念才被作为一个癌症的新标志而被接受。
免疫细胞参与了癌症相关炎症。由免疫细胞及其介质驱动的没有得到解决的慢性炎症，通过诱导癌基因突变、基因组不稳定和加强血管生成支持肿瘤的发展。这些导致了局部免疫抑制和支持恶性肿瘤细胞生存、扩增并积累更多的突变及表观遗传学变化的微环境的形成。此外，多个研究都强调了大部分的肿瘤都被单核细胞、巨噬细胞、不成熟DC、肥大细胞、中性粒细胞以及所谓的髓系来源的抑制性细胞所浸润。这些细胞在肿瘤发育、侵袭以及转移中发挥了重要作用。根据对不同环境信号的应答，髓系细胞可以启动不同的功能程序。与肿瘤促进的炎症相关，髓系细胞产生生长因子、细胞因子、活性氧自由基（ROS）以及活性氮中间体（RNI）。这些能够诱导组织损伤或损伤诱导的细胞增殖，导致转化细胞获得额外的恶性性质。此外，炎症细胞产生的细胞因子可以提高前恶性细胞中的ROS和RNI水平。肿瘤相关炎症促使更多的ROS和RNI以及多种细胞因子的产生。现在已经明确诸如IL-1、IL-6、IL-8、IL-18和肿瘤坏死因子（TNF）这样的细胞因子以及诸如转化生长因子-β和血管内皮生长因子的生长和分化因子在肿瘤发生和发展中起着重要作用，因为这些诱导了持续的细胞生长并抑制了抗肿瘤免疫反应并因此阻止了对恶性细胞的消除。在肿瘤发展期间，这些细胞因子激活了前恶性细胞中诸如信号转导和激活转录因子3（Stat3）以及核因子-κB（NF-κB）的关键转录因子。这些转录因子控制着促进肿瘤生长的多种过程因此构成了正性反馈回路的一个构成部分。比如说，NF-κB和Stat3诱导吸引更多的免疫细胞以保持肿瘤相关炎症的趋化因子的生成。这样就生成了一个恶性循环，其中免疫细胞和相邻细胞相互作用从而干扰了组织稳态并驱动了恶性细胞的形成。
3.2 从免疫监视到免疫编辑
在炎症环境中产生的肿瘤中或是在被炎症浸润的晚期肿瘤中，免疫系统的净效果为对肿瘤病程的刺激。但是，关于一个被称为肿瘤监视的长期机制的假说辩称免疫系统会识别并摧毁新生的转化细胞。肿瘤相关抗原的发现为这个假设提供了合理解释。这些TAA使得免疫系统能把肿瘤细胞与健康细胞区分开来并在新生肿瘤细胞有时间产生临床表现之前将其摧毁。此外，使用免疫缺陷动物模型的实验结果强化了免疫系统能对肿瘤的攻击做出应对这一概念，因为结果表明免疫缺陷动物相较于具有免疫能力的对照对于自发的和致癌物诱导的癌症都更为敏感。
有人提出肿瘤细胞最初募集包括自然杀伤细胞、自然杀伤型T细胞、γδT细胞和巨噬细胞在内的固有免疫细胞。这些通过产生IFN-γ在其他细胞中提供了第一线的防御，后者可以抑制肿瘤细胞增殖并在一定程度上诱导肿瘤细胞凋亡。还有，IFN-γ诱导肿瘤细胞和宿主细胞产生血管生成抑制性趋化因子。这个导致了新生血管生成的减少从而促进肿瘤细胞死亡。除此之外，这些趋化因子还参与了DC和T细胞的募集。这些细胞对于有效的抗肿瘤免疫反应很关键。作为专职的APC，DC能吞噬死亡的肿瘤细胞并获取TAA。它们被处理成肽段并在DC达到肿瘤引流淋巴结时被分别以主要组织相容性复合物（MHC）I和II的形式递呈给CD8+和CD4+T细胞。通过T细胞受体对MHC/肽复合物的识别并受到额外刺激的前提下，T细胞被激活了。这时CD4+T细胞变成了辅助性T细胞（TH）或调节性T细胞。从一个有效的抗肿瘤免疫反应的观点来看，较优的CD4+T细胞分化是分化成TH1表型，因为TH1参与了DC的作用，支持对CD8+T细胞反应的刺激和维持还有对肿瘤的排除。就CD8+T细胞而言，激活导致向细胞毒T淋巴细胞表型的分化，例如通过分泌细胞因子（IFN-γ和TNF-α）、释放穿孔素和颗粒酶以及表达诸如Fas配体和TNF相关的凋亡诱导诱导的死亡诱导配体来介导肿瘤细胞杀伤的细胞。
在免疫监视存在的前提下，就产生了为什么肿瘤在具有免疫力的个体中仍然会出现的问题。一个为人接受的观点是在一开始免疫监视可以应对肿瘤形成但是在免疫攻击期间，在免疫力完整的个体内能够生存下来的肿瘤细胞变异体是通过一种所谓的免疫编辑的过程而被选择的。在这期间肿瘤细胞处于产生IFN-γ的免疫细胞的持续压力下，导致了在表现出很多遗传不稳定性和突变的变异体中的选择并由此对于这些精心策划的免疫攻击产生了抗性。
3.3 肿瘤的反击
在肿瘤细胞进行雕琢或免疫编辑期间，被选择的肿瘤细胞获得了规避和/或主动中止抗肿瘤免疫反应的策略。一种机理就是通过抗原递呈机制上的缺陷来逃避免疫细胞的识别，包括MHC分子的下调或丢失、β-2微管蛋白的突变或是损害诸如tap结合蛋白的在抗原来源的肽生成中比较关键的蛋白的表达。紧接着，肿瘤细胞经常发展出逃逸CTL-介导的杀伤作用的策略。这其中包括表达抑制颗粒酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂PI9/SPI6、过表达凋亡蛋白抑制剂（IAPs）或是在IAP拮抗剂从线粒体转为到胞浆中时发生故障。此外，在很多情况下肿瘤细胞会表达高水平的FasL，这样诱导激活的表达Fas的T细胞死亡。
关于主动中止抗肿瘤免疫反应，应强调的是肿瘤可以通过多种机理诱导T细胞的无能化，包括（1）表达抑制性表面分子，例如可与激活的T细胞上的PD-1受体相互作用以诱导T细胞死亡程序性死亡1受体的配体（PD-L1）；（2）细胞因子的表达，例如TGF-β和前列腺素E2（PGE2），具有多种效应其中包括分别损害DC的激活和促使CD4+T细胞向Treg或TH2表型分化，或是（3）过表达诸如制造PGE2的环氧化酶2和将色氨酸代谢成有毒代谢物犬尿氨酸的吲哚胺-2.3-脱氧酶（IDO），后者消除了T细胞生存必需的氨基酸并且会诱导T细胞毒性，并且最后（4）过表达半乳糖凝集素，一种对半乳糖苷具有亲和力的聚糖识别蛋白，表现出天然的免疫抑制活性可以抑制抗肿瘤免疫反应。最后，肿瘤细胞能通过招募具有免疫抑制活性的炎症细胞来放大这种免疫抑制，其中包括Treg和MDSC。两种细胞亚群都能抑制CTL的活性并且肿瘤中这些细胞出现增多与癌症病人预后不良相关。
3.4. 通过肿瘤相关的抑制性免疫细胞对抗肿瘤免疫反应的破坏
3.4.1调节性T细胞
一种被肿瘤挟持以克服免疫攻击的细胞类型是Treg。通常Treg是作为针对过强的炎症和自身免疫反应的保护者。尽管在1970年就对Treg有所描述，花费了25年时间鉴定其为表达高水平CD25的CD4+T细胞。这个表型描述就是认识其作为肿瘤免疫中的关键角色的开端。
基于其个体发生学，Treg被分为起源于胸腺的自然生成Treg（nTreg），还有形成于外周的诱导型Treg（iTreg）。nTreg被鉴定为CD4+CD25highCD127lowFoxp3+的细胞，而iTreg被进一步细分为几个亚群，其中包括（1）获得了CD25highCD127lowFoxp3+表型的CD4+T细胞，（2）分泌IL-10的Tr1细胞以及（3）分泌TGF-β的TH3细胞。此外，抑制性淋巴细胞亚群的列表还在扩充。不理想的抗原递呈，例如通过不成熟的DC或是处于幼CD4+T细胞分化成Treg或是现存TH细胞转变成Treg所需的细胞因子组成（IL-10和TGF-β）中。这两种情况在肿瘤微环境中水平都有提升。
Treg抑制抗肿瘤免疫反应的机理因其亚群不同而异，其中包括接触依赖性机理、抑制性分子的分泌以及去除代谢物以抑制免疫效应细胞。现已表明在Treg上组成表达的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4），通过下调DC上的共刺激分子CD80和CD86来间接调节T细胞激活。后者可能解释了Treg破坏DC与效应T细胞接触的能力。至于分泌型的因子，对于DC和T细胞的抑制性效应是通过IL-10和TGF-β介导的这点毫无疑问。最近，还有迹象Treg通过清楚IL-2和腺苷三磷酸（ATP）发挥功能。关于前者，Treg和效应T细胞竞争IL-2，使其饥饿直至死亡。此外，Treg通过去除ATP，一种通过P2X7受体激活DC的危险信号来阻止从肿瘤微环境中获得了TAA的未成熟DC的激活来影响效应T细胞的激活。更有甚者，不成熟DC还会诱导Treg的生成并因此形成一个正反馈循环。因而Treg使用了不同的抑制机理，可以直接或间接的导致效应T细胞的减少。此外，Treg通过生成NF-κB受体激活因子配体（RANK-L）来增强肿瘤细胞的转移能力。刺激肿瘤细胞上的RANK受体加强其增至和转移能力。
在很多癌症中都报道了Treg出现在肿瘤中以及在外周中数量的增长并且与较差的疾病预后相关。因此，这就无怪乎在进行免疫疗法的同时耗尽Treg会增强怀有肿瘤小鼠的生存了。此外，现已表明在转移黑色素瘤病人中耗尽Treg会影响血中IFN-γ+CD3+T细胞的数量并使TAA-特异性的CD8+T细胞重新出现。但是，系统性的耗尽Treg可能会患自身免疫疾病。因此关键在于发展能选择性干扰Treg的策略。
3.4.2髓系抑制细胞
肿瘤细胞还主动在肿瘤位点和淋巴器官招募并营造了不成熟髓系细胞的网络。基于其在怀有肿瘤的小鼠和癌症病人中来源、聚积以及抑制性功能，可以对MDSC做出区分。在怀有肿瘤的小鼠中，这些细胞聚积在骨髓、脾脏、外周血、肿瘤的原发位和转移位还有淋巴节中。大部分小鼠模型中，免疫抑制性细胞群的表型被确定为Gr-1+CD11b+。髓系分化抗原Gr-1含有两个表位，被称为Ly6G和Ly6C。基于这些标记的表达和各自细胞的核形态学，MDSC被进一步细分为粒细胞MDSC（多叶核以及通常表型为CD11b+ Ly6G+ Ly6Clow）和单核细胞MDSC（单核以及通常表型为CD11b+ Ly6G+/- Ly6Chigh）。在特定的MDSC亚群中会表达额外的表面标记，其中包括IL-4受体的α链（IL-4Rα），巨噬细胞表面标记F4/80，巨噬细胞集落刺激因子受体或CD115以及共刺激分子CD80。在具有不同类型实体瘤的病人中，MDSC通常为CD11b+CD33+CD34+CD14-HLA-DR-而它们会在CD15的表达上有差异。在黑色素瘤和肝脏肿瘤病人，可以在血液中发现一群表型为CD14+HLA-DRlow的MDSC。这些结果意味着不同类型的肿瘤会诱导出不同类型的MDSC。
尽管MDSC的表型鉴定很难，还是进行了MDSC如何抑制T细胞反应的研究。已经确认了包括耗尽T细胞激活所需重要的氨基酸在内的多种机制。已经表明MDSC会耗尽环境中德精氨酸、半胱氨酸和色氨酸，导致T细胞激活和增殖的抑制。此外，通过表达IDO的MDSC对色氨酸的耗尽与犬尿氨酸的生成相关，后者接下来会影响T细胞活性。MDSC的抑制活性也牵涉到氧化物的生成，包括一氧化氮和过亚硝酸盐的生成。通过几个肿瘤来源的因素诱导ROS的生成，包括TGF-β、IL-10、IL-6、IL-3和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。重要的是，在体外通过抑制ROS的生成完全逆转了MDSC的抑制能力。另一种作用模式包括下调T细胞上的L选择素（CD62L），一个T细胞归巢到淋巴结所必需的分子。就这样，MDSC阻止了效应T细胞的激活。最后，已表明MDSC可以在体内促进Foxp3+ Treg的重新诱导。
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）代表着肿瘤微环境中的另一个重要细胞组分。取决于激活TAM的不同因素，它们可以发挥抗肿瘤或促进肿瘤的活性。由IFN-γ激活的巨噬细胞（M1）具有杀肿瘤活性。在接触过IL-4或IL-13后，巨噬细胞经历了另一种激活而转变为所谓的M2巨噬细胞，后者可以促进肿瘤生长。M2巨噬细胞促进恶性肿瘤细胞的增殖和生存、破坏适应性免疫反应并促进血管生成、基质重构以及转移的形成。在大多数而非全部肿瘤中，TAM的表型为M2。它们表达低水平的MHC II类分子并且分泌促进血管生成的因子，诸如VEGF和PGE2以及抗炎症因子IL-10。另一方面它们分泌低水平的亲炎症因子IL-12并表现出对M2特异性基因的上调，其中包括精氨酸酶。肿瘤细胞分泌的银子，诸如IL-10、CSF-1和VEGF，激活巨噬细胞并迫使其做出M2样巨噬细胞的行为。现已表明不同的趋化因子（例如：CCL17、CCL22和CCL2）能吸引巨噬细胞到肿瘤并促进其向M2极化和生存。在塑造TAM的表型方面有一个关键的环境条件就是肿瘤造成的局部缺氧。缺氧区域的出现是大部分实体肿瘤的特征。Movahedi等表明在不同的肿瘤区域内存在着多种不同的TAM亚群。他们表明具有促进肿瘤活性的MHC II低表达的TAM富集在肿瘤的缺氧区域内，而具有抗肿瘤活性的MHC II高表达的TAM则富集在含氧量正常的区域。这表明肿瘤不同区域内的TAM具有特异化的功能。
不成熟DC是另外一类具有免疫抑制而非刺激性质的髓系细胞。尽管已表明DC是免疫系统中识别、获得、处理和向T细胞递呈抗原能力最强的APC。肿瘤细胞、Treg和MDSC会妨碍DC的功能已经为人所熟知。DC在分化和成熟上的缺陷是造成肿瘤逃逸的一个重要因素。在癌症病人中，已表明生长中的肿瘤仅含有数量有限呈现不成熟DC表型的DC，共刺激分子CD80和CD86低表达。甚至向从肿瘤中分离出来的DC加入已知可以上调CD80和CD86表达的因子，诸如GM-CSF和CD40配体（CD40L）都不能熬成这些分子的上调。不成熟DC不仅在诱导抗肿瘤免疫上有缺陷，它们甚至还诱导肿瘤耐受。这意味着为了在使用DC为基础的免疫疗法中诱导有效的抗肿瘤免疫反应，为了促进T细胞激活而非T细胞失能DC需要被正确的激活以便向T细胞传送共刺激信号。
4. 利用免疫系统对抗癌症
免疫疗法的概念已经成熟。利用免疫系统来对抗癌症的理念因为关于TAA及针对其的免疫反应的研究而得到极大丰富。现在，免疫疗法被视为针对癌症的第四种治疗方式。已经探索了很多不同的方案，其中一些已经成为标准癌症疗法的一部分，还有一些仍处于试验阶段。可以分为被动和主动策略。被动免疫疗法策略包括给予（1）细胞因子，诸如IL-2和IFN-γ，（2）针对TAA的单克隆抗体，诸如HER2，（3）针对应对抗肿瘤免疫反应分子的单克隆抗体，诸如CTLA-4和PD-1，（4）肿瘤特异性T细胞。这些策略的优点在于反应的动力学。但是，这些策略中很多具有毒性，并且不能诱导记忆型T细胞生成而需要延长治疗。与之相反的，主动的免疫疗法策略使用病人的免疫系统来诱导抗肿瘤免疫并且是以使用TAA接种为基础的。这些疫苗包括肽或蛋白/佐剂疫苗、基因改造过的肿瘤细胞或裂解物、编码TAA的核酸、编码TAA的重组病毒载体以及TAA递呈DC疫苗。成功的主动策略的优点在于较低的毒性、肿瘤特异性和持久的保护。尽管很多应用抗癌免疫疗法的试验报告了相对较弱的反应，需要注意的是在淋巴细胞耗竭后的过继T细胞传输以及以DC为基础的疫苗在清除黑色素瘤病人中的大量肿瘤负荷方面前景良好。
过继T细胞免疫疗法依靠的是将体外扩增和激活的肿瘤特异性自体淋巴细胞回输到肿瘤病人体内。最初，这些细胞是体外扩增的IL-2激活的杀伤细胞或是浸润肿瘤的淋巴细胞（TIL）。在单臂的临床二期试验中，针对转移性黑色素瘤病人TIL诱导的目标反应率达到了50%。但是，在试验早期确认了一些问题，其中包括从一些病人身上获得的TIL无法培养。此外，这些T细胞中的大部分特异性未知。最后，某些TIL不能识别自体肿瘤细胞。先行者的工作强调了开发用于获得足够数量的肿瘤特异性和具有活性的T细胞的技术的需求。因为来自病人的肿瘤反应性T细胞的扩增是个挑战并且因为对于TCR重排的研究表明其高度变异性，现在主要致力于基因改造的T细胞，例如：通过抗原特异性受体的遗传输送来产生肿瘤特异性的T细胞，其中含有MHC限制性的TCR或是非MHC限制性的合成的嵌合抗原受体（CAR）。这个方案对病人相对比较方便，因为不需要肿瘤的可接近性并且为了或的用于基因改造的外周血T细胞而进行的白细胞去除法相对简单。
将编码Melan-A/MART-1特异性TCR的α和β链基因运送到黑色素瘤病人的淋巴细胞的第一次尝试使用的是γ-RV。尽管前景可期，对于γ-RV诱导的插入突变事件的担忧需要使用一个诸如LV的更为安全的代替品。通过TCR基因传输对用于免疫疗法的T细胞进行改造产生了一个60%-80%为转基因TCR且主要为CD8+效应表型的T细胞群体。这些转基因的T细胞能够特异性的响应表达抗原的肿瘤细胞而分泌细胞因子并杀伤前者。此外，它们在体内发挥了显著的疗效。将T细胞的归巢、组织穿透和靶细胞破坏能力与抗体特异性相结合的CAR技术首次在1993年被报道。第一代CAR由特异性的抗原结合域、单克隆抗体的可变区域组成，后者是将一个单链抗体（scFv）和一个来自TCR/CD3复合物ζ-链或是FcRIγ-链的信号结构域连接而成。从此之后，新一代的CAR将共刺激信号结构域合并为CAR的一部分，这其中包括CD28、4-1BB或是OX-40。这些分子或是作为一个单独结构被并入或是作为多个结构域串联在CAR中。重要的是，这些CAR被抗原触发后紧接着发生T细胞增殖并分泌IL-2，甚至不需要APC的交叉递呈。TCR以及CAR改造T细胞都有一定临床效果。尽管这些T细胞在体外功能活性很高，它们都承受着免疫抑制机制。因此，有必要采取额外措施来保护这些T细胞以保证最大的临床效果。
用DC进行疫苗接种的基础在于这些APC在固有和适应性免疫中发挥了重要作用。为了发挥其刺激功能，DC需要负载TAA并被正确激活。抗原负载可以是肽段或全长蛋白。但是，两种策略都有缺点，需要关于TAA来源的肽段以及可以被递呈的肽的范围的先验知识。已经开发出了多种方法来改造DC，不在本文的讨论范围之内。这其中，LV表现出能有效地转导由功能减退的CD34+祖细胞或是静息期的CD14+祖细胞分裂而来的DC。多个研究表明在体外转导LV的人和小鼠DC能刺激出分化后的CD4+和CD8+T细胞以及幼T细胞对于很大一个范围的TAA的反应。此外，LV转导的小鼠DC可以诱导产生免疫反应来保护接种后的肿瘤侵袭并且甚至具有治疗性。近二十年来对于DC在体内诱导有效的抗肿瘤免疫反应的能力进行了评价。多个研究表明LV作为抗肿瘤疫苗和肽段/佐剂或DC疫苗等效。这都是由于LV诱导了DC激活这一事实。
现在，针对DC的定点转导和转录进行了大量工作以提升LV/DC疗法的安全性和有效性。总而言之，用LV免疫能激活免疫反应性并使肿瘤消退。不幸的是，成功再次受到很多免疫抑制对抗措施的限制。如前所述，肿瘤的免疫抑制性微环境扼杀了在免疫的诱导以及免疫反应的效应阶段两个阶段扼杀了免疫疗法的效果。因此需要将改造肿瘤微环境和免疫刺激结合起来以增强疗效。在这方面，由于能有效转导肿瘤细胞LV是理想的候选者。
5.在癌症基因疗法中应用慢病毒载体的实验策略
癌症基因疗法使用了一系列多样的策略，包括基因编码的酶前药（自杀基因）疗法，传输编码促进凋亡分子的基因，增加对肿瘤细胞对化疗/放疗敏感度的分子，或是保护健康细胞不受细胞毒药物伤害，免疫调节分子以及抗血管生成分子。在很多策略中，LV被应用为基因运输系统，因为推断LV有更好的机会转导癌细胞，其中包括静息期和繁殖期的细胞。
表2 LV-载体癌基因疗法的策略
设计来诱导/使能肿瘤细胞杀伤的策略-自杀基因疗法-干扰细胞死亡疗法-化疗和放疗√加强肿瘤细胞对化疗或放疗的敏感型√保护造血干细胞不受化疗影响
以肿瘤血管为靶点
加强肿瘤细胞的免疫原性
肿瘤发展和维持中重要的转录因子为靶点-STAT3-NF-κB
5.1 设计用来诱导肿瘤细胞杀伤的策略
尽管癌症是一个复杂的疾病，很长时间以来认为这个疾病是由于细胞增殖的失调以及对凋亡或细胞死亡的错误控制。此外，诸如化疗和放射疗法的很多传统疗法也是基于诱导肿瘤细胞死亡的。但是在癌症细胞中，细胞死亡是由于多种机制而失调的。随着我们对肿瘤发生以及对治疗的抗性中潜在的凋亡分子机理了解加深，使得我们可以理性化设计针对凋亡通路的策略。关于这些我们会讨论直接干扰细胞死亡通路的策略以及加强肿瘤细胞对传统化疗和放疗敏感度的策略。在进入这个主题前，我们将讨论一个以所谓自杀基因为基础的疗法，一个以简为美的策略。
5.1.1自杀基因疗法
基因指导的酶前药抗癌策略包括将一个自杀基因运送进肿瘤来产生一个酶激活一个插入前药成为细胞毒性药物。研究比较透彻的自杀基因/前药组合是单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）以及胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞苷（CD/5-FC）组合。
HSV-TK酶磷酸化GCV成单磷酸形式，然后由细胞激酶转变为GCV三磷酸。后者导致DNA链终止以及细胞死亡。据我们所知，Obaru等是第一个报道用LV载体运送HSV-TK至T淋巴细胞，并在给药GCV后表现出肿瘤杀伤作用。LV载体输送HSV-TK并在加入GCV后诱导细胞死亡这一模式被拓展到很多其他肿瘤模型，包括前列腺肿瘤、胶质瘤、肝细胞肿瘤、骨和软骨肉瘤。在体内，自杀基因策略包括直接的细胞毒效应以及旁观者效应。旁观者效应将细胞毒性传递给邻接的非转导细胞并且主要通过胞间连接介导，毒性代谢物在其间传输。旁观者效应还与凋亡相关，通过活肿瘤细胞从死亡细胞中摄取磷酸化的GCV和/或诱导针对肿瘤的免疫反应。抗肿瘤反应是由于诱导了肿瘤特异性CD8+T细胞，可能主要由吞噬了死亡肿瘤细胞的APC诱导。这些现象意味着可以通过加强针对肿瘤细胞的免疫反应对这一策略进行改进。因此，无怪乎会将HSV-TK和诸如IL-2或GM-CSF的细胞因子基因联合输送的策略会成功的进一步刺激炎症和免疫反应。最近，通过利用真核启动因子4E（eIF4E）的功能加强该策略的选择性，这种因子经常在癌细胞中过表达。该因子加强选定数量的mRNA的翻译，其中包括生长因子以及其他已知与恶性肿瘤进展相关的蛋白。对翻译的加强是建立在对这些mRNA分子5’端非翻译区域（UTR）的展开。因此，将5’-UTR加入到HSV-TK的cDNA之前会显著加强其表达，但是仅在恶性细胞中，诸如前列腺肿瘤细胞中。
如前所述，CD/5-FC是第二个自杀基因疗法方案。在此策略中，经过基因工程加入了CD的细菌将无毒性的5-FC转变为化学毒素5-氟尿嘧啶。尽管此策略并未像HSV-TK/GCV那样受到充分开发而与LV联用，仍然表现出了相似效果，例如通过直接细胞毒效应以及旁观者效应有效的诱导细胞死亡。与HSVTK/ GCV的旁观者效应相比，CD/5-FC的旁观者效应不依赖于胞间连接而是通过5-氟尿嘧啶的扩散。重要的是，已表明CD/5-FC策略在人体结肠癌移植模型中有着显著的抗肿瘤活性。已表明使用表达CD的γ-RV可以将使用癌症胚胎抗原启动子的结肠癌细胞做为靶点。此外，当使用端粒酶启动子时可以对以LV为载体的CD进行选择性表达。
其他的自杀基因，诸如经工程改造过的胸苷激酶正在开发中。现已表明在使用NOD/SCID的小鼠体内经过胸苷激酶改造的癌细胞变得对3’-叠氮-3’-脱氧胸苷。
5.1.2干扰细胞死亡通路
癌细胞在正常的凋亡通路中有不少缺陷。已经对几个异常进行了描述，包括凋亡抑制因子（IAP）的过表达以及IAP拮抗剂没有能从线粒体转运至胞浆。II型线粒体来源的半胱天冬酶激活因子（SMAC），也被称作为低pI的凋亡结合蛋白直接抑制因子（DIABLO），现已表明作为IAP拮抗剂是一个令人感兴趣的治疗靶点。SMAC的线粒体定位信号的切割需要其被转运到胞浆。在胞浆中SMAC结合到IAP的杆状病毒IAP重复结构域，半光天冬酶的结合位点。因此，SMAC对IAP的结合导致效应因子半光天冬酶的释放并在之后诱导凋亡。关于这些，我们最近表明在体内LV可以运送经过处理的SMAC至肿瘤细胞，表明其能高效的延缓肿瘤生长并且在某些模型中甚至可以治愈癌症。
另一个被利用的靶点是诱导肿瘤细胞死亡，其中包括B细胞淋巴瘤2家族（Bcl-2家族）、死亡受体、肿瘤抑制因子p53并且还和小鼠双微体癌基因有关（MDM2）。Bcl-2家族包含抗凋亡和促进凋亡的成员，同时含有保守的Bcl-2同源性（BH）结构域控制器形成二聚体的能力并发挥作为凋亡调节因子的功能。抗凋亡的成员，诸如Bcl-2和B细胞淋巴瘤特大（Bcl-2-XL）以及促进凋亡的Bcl-2相关的X蛋白（Bax）成为LV载体的靶点。由Bax诱导的凋亡会受到Bax抑制因子-1（Bi-1）的抑制，这是一个在线粒体凋亡通路中发挥重要作用的抗凋亡蛋白。现已表明通过将针对Bi-1的短发卡RNA（shRNA）运送到人体鼻咽癌细胞来下调Bi-1在体内和体外都诱导了凋亡。结合这些数据，已表明使用四环素调控的基质金属蛋白酶2启动子的肿瘤特异性的Bax上调有效的诱导肿瘤细胞凋亡。最近，有报道反映通过将shRNA运送至慢性髓系白血病（CML）以沉默BCR-ABL，可以通过阻止Bcl-XL表达、出发Bax表达并激活半胱天冬酶而触发CML凋亡。在肿瘤细胞中过表达Bcl-2与抗凋亡效应相关。多个报告表明使用shRNA下调Bcl-2的表达会有利于可溶性TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导的肿瘤细胞凋亡。此外，阻断Bcl-2会加强多柔比星诱导的骨癌细胞细胞毒性，作为直接的细胞毒性和对于邻接细胞的旁观者效应的结果。应注意的是与Bcl-2下调和运送可溶性TRAIL联用结果相反，LV载体导致的TRAIL过表达会导致对肿瘤细胞死亡的抗性。解读完全相反的结果背后的机理，表明TRAIL与内源性的TRAIL受体在内质网/高尔基体腔体内相互作用，暗示TRAIL受体的信号作用可能需要其位于胞膜上。
肿瘤抑制因子p53是一个具有抗肿瘤活性的分子，在癌症中经常因突变或缺失而被失活。因此，在缺乏p53的肿瘤细胞系中过表达野生型p53会导致生长停滞以及凋亡或者使被转导的细胞对于化疗药物敏感。但是，一般的人体肿瘤表达野生型p53。癌基因产物MDM2是一种泛素蛋白连接酶，通过促进p53向核外转运以及之后的降解来抑制其活性。有人建议使用nutlin拮抗MDM2提供了一种干扰p53-MDM2蛋白-蛋白相互作用的策略并以此来激活p53。Nutlin-3是一种能和p53-MDM2交界面结合的小分子，可以利用LV载体在神经母细胞瘤中进行过表达而通过诱导G1细胞周期静息和凋亡产生明显的抗增殖和细胞毒效应。
最后，多个分子在经LV载体过表达后都与肿瘤细胞死亡相关。这其中的一些，例如已表明骨髓的主要调节因子PU.1会在白血病中诱导凋亡，还有其他的，例如已表明参与视网膜胚胎发育的癌症相关基因PAX6会加强细胞增殖并抑制视网膜母细胞瘤的凋亡。
以上策略可以总结为关于癌症治疗的细胞毒策略。在本文中要重点介绍免疫原性细胞死亡的概念，规定为抗肿瘤免疫诱导的细胞死亡。免疫原性细胞死亡通常伴随着接触钙网蛋白（CRT）和高迁移率族蛋白（HMGB1）以及ATP，导致死亡细胞被诸如DC的APC摄取并通过TLR4和P2X7触发将其激活。这导致了向T细胞进行TAA递呈。我们最近表明通过SMAC的过表达诱导的癌细胞死亡有几个免疫学结果。我们不仅发现TAA-特异性的CTL被DC交叉激活，还发现了Treg的显著下调。这些免疫原性细胞死亡效应并非通过被确认的通常分子机制，因为我们未曾观察到HMGB1或ATP，暗示着DC激活是以其他机理为基础的。
5.1.3关于优化化疗和放疗的慢病毒载体
对于细胞毒药物以及放射疗法的抗性及其对病人严重的副作用是癌症治疗的主要临床挑战。LV载体被用来直接把癌细胞作为靶点并对其进行清除以及保护骨髓细胞不受药物诱导的细胞毒性伤害。其中增强细胞对放射疗法敏感性的一个最简策略就是恢复恶性肿瘤细胞中的钠/碘共转运体（NIS）表达。Dingli等在多个多发性骨髓瘤中使用了该策略，表现出了高水平的I积聚随后就是肿瘤细胞的清楚以及肿瘤小鼠的长期生存。自此之后，在结肠癌、未分化甲状腺癌中也表现出了对利用LV载体过表达的NIS的收益，并且在肝细胞癌中在与HSV-TK/GCV策略联用时也表现了收益。
对于过表达或下调生长因子来加强肿瘤细胞对于化疗的敏感性的可能性也作了探索。过表达肝细胞生长因子，尽管已知会加强细胞的运动和侵袭，被报道会通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38通路增强对卵巢癌细胞的化疗杀伤作用。抑制胰岛素生长因子-1或是缺氧抑制因子-1表现出分别能增强胃肠道癌细胞和非小细胞肺癌对化疗的敏感性。
化疗对骨髓具有毒性因此经常会诱导造血细胞减少。这是由于在骨髓细胞中的表达O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）。MGMT是一种能从鸟嘌呤O6位置去除烷基加合物的DNA修复蛋白，这样能防止细胞凋亡。已表明MGMT的突变体，MGMT-P140K能保护细胞不受烷基化药物伤害并且在几个临床前模型中将其输送到造血干细胞中能恢复造血功能，同时还能清除表达野生型MGMT的肿瘤细胞。
5.2 以肿瘤血管为靶点的慢病毒载体
新生血管的形成对于肿瘤细胞获得营养和转移癌细胞的传播至关重要。因此，以肿瘤血管（血管生成）为靶点在代表了一种控制肿瘤生长、进展和转移的重要策略。几种方法，包括使用诸如血管抑素、内皮抑素、金属蛋白酶抑制剂等内源性的血管生成抑制因子，作为以LV为载体的肿瘤血管为靶点的策略中。
首次使用LV作为载体输送抗血管生成因子大约在10年前。Pfeiffer等表明用PEX，一种MMP-2的非催化片段转导人内皮细胞可以在一个裸鼠模型中抑制肿瘤诱导的血管生成以及肿瘤生长。紧跟着，报道了使用编码内皮抑素和血管抑素转导内皮细胞和人膀胱癌细胞，表明抑制了癌细胞增殖。更近一些的时间，表明了用表达血管抑制肽alphastatin的LV转导人脐静脉内皮细胞能显著抑制VEGF诱导的内皮细胞血管生成。与之相似的，编码一种具有抗血管生成和抗炎作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂kallistatin的LV载体，被用来抑制转移肿瘤的生长并延长肺癌小鼠的生存，其结果与微血管密度的降低，VEGF、TNF-α和活性NF-κB水平的降低相关。由于与上皮细胞相比内皮细胞更难被具有VSVG包膜的LV载体所转导，进行了大量工作来将转基因表达限制在内皮细胞，使用了一系列内皮细胞特异性的转录调控序列，诸如带有Ig的酪氨酸激酶以及表皮生长因子同源结构域（Tie-1、Tie-2）、胎肝激酶-1（Flk-1）以及细胞间黏间黏附-2（ICAM-2）。后者加强了特异性因而提高了以肿瘤血管为靶点策略的安全性。
5.3 加强肿瘤细胞免疫原性的LV载体
使用基因改造过的肿瘤细胞作为细胞性抗癌疫苗的创意由来已久。为达到这目的，肿瘤细胞需要具有一些APC的特性。将TAA在MHC分子条件下进行递呈同时携带共刺激信号。已表明后一策略在白血病中尤其可行。利用表达GM-CSF或CD80的LV载体来改造急性淋巴细胞性白血病（ALL）和急性髓系白血病（AML）细胞，已表明这些细胞获得了刺激T细胞增殖的能力，此能力与加强对肿瘤细胞的识别相关。又更近一步表明经过GM-CSF和CD80改造的细胞能够刺激TH1细胞和CTL。通过联合使用诸如GM-CSF、IL-4、FMS样酪氨酸激酶配体-3等免疫调节因子和CD40L可以将AML细胞分化为完全功能的APC。在这些策略中，使用LV载体被证明是基因工程改造的白血病细胞为基础的疫苗中简单、多功能而且可靠的方案。
5.4 用于癌症发展中重要的靶转录因子的LV载体
如前所述，转录因子NF-κB和Stat3在癌细胞中发挥重要的作用。它们控制着抗凋亡和促增殖基因的表达。此外，还控制着肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞之间的交流。在包括结肠、胃和肝癌等多种类型的癌症中，都表明了NF-κB和Stat3会促进肿瘤发育和进展。尽管Stat3的促肿瘤作用已经明确，NF-κB则同时发挥抑制肿瘤和促进肿瘤的作用。因此，阻断转录因子的策略需要根据不同癌症类型进行评价。
在乳腺癌中NF-κB的活性受到miR-146以及包括诸如IL-1受体激酶和肿瘤坏死因子受体相关因子-6的信号衔接分子下调的控制。现已表明miR-146的过表达导致IL-6、IL-8和MMP-9表达减少以及乳腺癌细胞的迁移和侵袭减弱。在胶质母细胞瘤中，已表明通过过表达NACHT富亮氨酸结构域和含嘌呤蛋白2（NALP2）抑制NF-κB能抑制细胞增殖。
由于Stat3在肿瘤侵袭和转移中发挥着重要作用，利用LV载体运送shRNA将Stat3阻断被视为一个有前景的策略。已表明在胶质母细胞瘤中Stat3下调会抑制肿瘤生长。这一策略可以拓展到胶质母细胞瘤干细胞、髓细胞性白血病K562细胞、胰腺癌细胞、结直肠癌细胞以及黑色素瘤中。在这些研究中下调Stat3通过何种机理抑制肿瘤生长因其对细胞周期进展的阻止而异，Bcl-2、细胞周期蛋白-D、VEGF、MMP-2和MMP-7表达的下调已证实了Stat3在促进肿瘤病程中的关键作用及其作为癌症基因疗法靶点的价值。
6. 从一个试验性的策略到一个现成的治疗性策略
现已表明LV对于癌症疗法来说是一种具有吸引力的基因运送载体。LV不被考虑作为临床使用的基因传输载体，由于它们来源于HIV-1。风险过大以至于无法考虑收益。在过去的10年里，LV技术产生了巨大的变化，解决了几个受关注的问题。
被认为是主要不良事件之一的就是产生RCL的潜在可能。目前，尚未有关于LV包装系统的RCL的报道。制造时将顺式和反式作用序列分开可以部分解释这一事实，还有一个解释就是SIN LV产生RCL的可能性较低。还要对LV的整合能力进行详细审查。尽管这确保了在转导细胞中长期表达转基因，却会带来插入突变的风险。应注意的是最近的研究表明与γ-RV相比LV还是有很低倾向将其前病毒DNA整合至人体基因组的危险区域。为此开发了IDLV，使得我们可以在没有插入突变的风险下进行足够的基因表达。最后，脱靶效应转导也是一个注意点，预想之外转基因可能会导致系统毒性或者是被转导的APC将转基因表达产物进行递呈，尽管后者有利于TAA的传输。明显的，脱靶转导的越多，发生前述问题之一的风险就越大。载体靶向可以通过局部运送解决，例如将LV注射进肿瘤或是通过向心血管。但是，这引起了对非实体肿瘤和转移癌细胞的实用关注。靶标LV的系统性给药之后再选择性转导靶细胞和/或在靶细胞中转基因表达才是终极目标。为了这个目的，开发了利用特异性启动子的靶向转录以及使用靶点特异性LV进入的靶向转导。
关于靶向转录，LV的表达盒被改造成转基因只能在特异性的靶细胞中被转录。在临床前模型中利用了几个策略来以癌细胞为靶点。比如说在转移性前列腺癌中，利用前列腺特异性抗原启动子、前列腺干细胞抗原启动子或是将前列腺特异性的启动子ARR2PB和一段位于5’-UTR中由eIF4E识别的短DNA序列联用来进行靶向。现已表明大鼠α-甲胎蛋白的启动子成分能限制肝癌细胞中的转基因表达。基于MMP-2、人端粒酶反转录酶的普遍表达以及NF-κB的组成型激活的普遍表达发展了更为通用的策略。使用一系列内皮细胞特异性的转录调节序列来靶向肿瘤血管，诸如Tie-1、Tie-2、Flk-1和ICAM-2。尽管在以上研究中表现出了细胞特异性的表达，由于使用了具有广泛转录亲嗜性的靶向LV，插入突变的风险并未减小。
因此，LV对肿瘤细胞的靶向转导在解决这个安全性问题中看起来更令人感兴趣。由于LV的亲嗜性是由其包膜糖蛋白决定的，利用假型病毒可以产生具有特异性转导模式的LV。为了生产出具有广泛亲嗜性的LV，选择VSV作为假型病毒包膜糖蛋白。有几个实验室报道使用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的糖蛋白作为LV的包膜可以近乎将星形胶质细胞作为唯一靶点，后者是恶性胶质瘤细胞的主要来源。此外，Morizono等报道了在小鼠癌症模型中使用改造过的嵌合辛德毕斯病毒包膜作为LV的假型可以特异性的将黑色素瘤细胞作为靶点。由于依靠自然产生的糖蛋白无法靶向所有的肿瘤细胞，已经发展了几个策略来获得能进行癌细胞靶向的糖蛋白。这些策略包括：（1）对包膜糖蛋白进行基因改造以加入靶向配体，诸如单链抗体和生长因子，（2）一端识别病毒糖蛋白而另一端与靶细胞上的限定分子结合的分子桥梁，（3）通过制造LV的细胞过表达宿主细胞蛋白，后者在LV通过出芽方式从制造细胞中释放时展示在LV表面以及（4）通过LV表面上两个不同分子分别进行结合和融合。最近有人提出使用纳米抗体（Nbs）来讲LV靶向特异的细胞类型，在一项被称为Nb展示技术的策略中。在此策略里，将一个结合缺陷但具备融合能力的VSV.G（VSV.GS）和一个纳米抗体的表面结合形式联合使用。后者能介导靶点特异性的结合，而前者在这之后介导LV膜与靶细胞膜的融合。由于一个纳米抗体的抗原结合部分仅由一个被称为VHH或Nb的单一可变区域组成，这些分子有很多优点：（1）它们具有高度可溶性，（2）在变性后可以重新折叠而获得结合活性，（3）抗原特异性的Nbs克隆和选择避免了建库及筛选。
癌细胞特异性Nbs的表达在制造LV的细胞膜可以在出芽时产生包膜中含有肿瘤特异性Nb的LV。除此之外还提到了几个肿瘤特异性的Nbs诸如能识别表皮生长因子、表皮生长因子受体2、干细胞生长因子和癌胚抗原（CEA）的Nbs。最后，还需要提到的是两种策略的结合，例如：靶向转录和靶向转导，可以进一步增加以LV为基础的基因疗法的安全性、有效性和适用性。
总而言之，通常认为基因运输载体的系统性给药更为可靠、简单，对于影响多个组织的疾病诸如癌症的治疗也更为诱人。为了加强安全性和疗效，在将LV为基础的癌症基因疗法由市实验向临床转化时进行LV靶向已经势在必行。
7. 结论
反转录病毒可以通过激活原癌基因诱导突变这一知识并没有阻止将γ-RV用于临床目的开发。实际上，γ-RV被用于将基因稳定传输至T细胞并在这之后用于治疗黑色素瘤病人。尽管γ-RV在很多临床试验中都被安全的使用，在法国的SCID-X1试验中产生的白血病是γ-RV研究以及整个基因疗法领域中的一个重大挫折。此外，这项研究刺激着寻找与γ-RV同样有效而没有γ-RV的缺陷的替代品。
由于其转导分裂和非分裂细胞以及在较低风险下整合进细胞基因组的特殊能力，LV开始在基因治疗领域受到越来越多的关注。不同代次的包装系统，强化的传输载体以及病毒包膜使得应用HIV-1来源的LV近来变得更加安全和有效。发展出了使用LV作为载体治疗癌症的不同策略并且由LV介导的基因疗法前景可期。
目前在http://www.wiley.com//legacy/wileychi/genmed/clinical/网站上有记录的，使用LV载体进行癌症治疗或是用于加强癌症治疗的临床试验有15项。这其中，有13个试验是使用LV作为载体将TCR或CAR运输至T细胞，而有1项是将转导了MGMT-P140K的自体造血祖细胞回输以保持正常造血。我们强烈确信可以对LV做进一步精炼，包括将对细胞的靶向转录及靶向转导和通过将自杀基因构建进病毒而进行控制的IDLV联用。这样的精炼，加上已经在数个临床前模型中证明了有效性的策略使得在很近的将来我们可以使用LV对癌细胞和免疫细胞进行原位改造，诸如DC以及肿瘤相关细胞。
参考文献：
Emeagi PU, Goyvaerts C, Maenhout S, Pen J, Thielemans K, Breckpot K.Lentiviral vectors: a versatile tool to fight cancer.Curr Mol Med. 2013 May;13(4):602-25.
注明：姓名+研究方向小丸工具箱报毒！
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